用CRISPR/Cas9n 系统构建Asxl2 基因敲除的NIH3T3 稳定细胞系

更新时间:2015-10-13

【摘要】目的利用CRISPR/Cas9n 系统在NIH3T3 小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2 基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2 基因第5 个外显子的小向导RNA（sgRNA），分别克隆进pX462 载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3 细胞中，利用有限稀释法得到单细胞，通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA，ge?notyping PCR 扩增出靶位点附近的DNA 片段并测序。利用Western blot 方法检测细胞株中Asxl2 的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2 的CRISPR/Cas9n 重组质粒。将2 个重组质粒共转染NIH3T3 细胞，嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系，并且经genotyping PCR 测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot 证实敲除Asxl2 后，该NIH3T3 细胞系中Asxl2 蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2 的CRISPR/Cas9n 重组质粒及稳定敲除Asxl2 的NIH3T3 细胞系。

【关键词】 ASXL2 CRISPR/Cas9n CRISPR 系统 表观遗传

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